α-半乳糖苷酶(a-D-galactoside galctohydrolases,EC3.2.1.22)屬于外切糖苷水解酶(exo-glycosidase)的一種,分屬于糖苷水解酶中GH4、GH27、GH36、GH57和GH97等多個(gè)家族
該酶廣泛的存在于微生物、植物動(dòng)物中,可特異性水解半乳糖殘基的非還原性末端α-1→6半乳糖苷鍵。20世紀(jì)70年代起,我國(guó)開(kāi)始對(duì)該酶的開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行研究,該酶被認(rèn)為是食品工業(yè)、輕工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥業(yè)中具有應(yīng)用潛力的酶制劑之一。本文從α-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌種選育出發(fā),探討產(chǎn)α-半乳糖苷酶的碳源誘導(dǎo)機(jī)制,優(yōu)化其固體發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成,在此基礎(chǔ)上以廉價(jià)的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為培養(yǎng)基開(kāi)發(fā)“以α-半乳糖苷酶為標(biāo)志”的飼用復(fù)合酶制劑。
論文的主要研究結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)采用X-a-Gal初篩、液體搖瓶復(fù)篩并進(jìn)一步考察固體發(fā)酵能力,從實(shí)驗(yàn)室保存菌株及傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩到菌株J-08,具有良好的液體發(fā)酵(3.88U/mL)及固體發(fā)酵(57.21U/g干基)產(chǎn)酶能力,將其編號(hào)為zju-Y1。經(jīng)形態(tài),BIOLOG生理生化分析及18S rRNA分子鑒定后,確定該菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)。研究多種農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物對(duì)黑曲霉zju-Y1產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響,并通過(guò)分析各農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物組分推測(cè),水蘇糖是黑曲霉zju-Y1產(chǎn)α-半乳糖苷酶有效的誘導(dǎo)因子之一。進(jìn)一步采用單一碳源發(fā)酵驗(yàn)證,確定在小分子量碳源(單/寡糖)中,水蘇糖具有顯著的誘導(dǎo)產(chǎn)酶效應(yīng),而在大分子碳源中瓜爾豆膠的誘導(dǎo)效應(yīng)為顯著。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同碳源誘導(dǎo)下黑曲霉zju-Y1三個(gè)α-半乳糖苷酶表達(dá)基因(aglA、aglB、aglC)在轉(zhuǎn)錄水平上的分析可知,三個(gè)基因?qū)μ荚吹恼T導(dǎo)敏感度為aglC>aglB>aglA;碳源對(duì)基因表達(dá)上調(diào)程度的影響為：水蘇糖>瓜爾豆膠>半乳糖>葡萄糖。進(jìn)一步對(duì)黑曲霉zju-Y1生物質(zhì)降解酶調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析認(rèn)為,轉(zhuǎn)錄激活因子X(jué)lnR及AmyR對(duì)α-半乳糖苷酶表達(dá)基因可能存在調(diào)控作用。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定采用250mL三角瓶固體發(fā)酵黑曲霉zju-Y1生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為28℃,培養(yǎng)基初始水分含量為60%,初始pH為5.5,接種量12%,載曲量為25g(濕基)。
以農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物(豆粕、麩皮)為主添加少量誘導(dǎo)物作為培養(yǎng)固體基質(zhì),經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后得到培養(yǎng)基組成為(g/10g干基)：豆粕粉1.3782g,麩皮8.0916g,瓜爾豆膠0.4802g, KH2PO40.01g, MnSO4·H2O0.04g。用此培養(yǎng)基發(fā)酵96h后大酶活為265.934U/g干基。實(shí)驗(yàn)表明黑曲霉zju-Y1具有強(qiáng)大的水解酶酶系,在纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和酸性蛋白酶等方面均有良好的產(chǎn)酶能力。本文在優(yōu)化的α-半乳糖苷酶固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析方法分別建立纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和酸性蛋白酶培養(yǎng)基組成與酶活響應(yīng)值得函數(shù)模型。分別設(shè)計(jì)家禽/畜用復(fù)合酶復(fù)配比例,應(yīng)用窮舉法數(shù)值計(jì)算,獲得滿足設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基組成。通過(guò)黑曲霉ziu-Y1單一菌種一次發(fā)酵,獲得“以α-半乳糖苷酶為標(biāo)志”的家禽用復(fù)合酶制劑A,其組成為α-半乳糖苷酶243.67U/g干基,纖維素酶431.62U/g干基,α-淀粉酶339.77U/g干基,果膠酶382.19U/g干基,酸性蛋白酶為3689.16U/g干基；以及家畜用復(fù)合酶制劑B,其組成為α-半乳糖苷酶235.66U/g干基,纖維素酶428.17U/g干基,α-淀粉酶362.73U/g干基,果膠酶359.21U/g干基,酸性蛋白酶為3614.25U/g干基。分析復(fù)合酶制劑的酶學(xué)性質(zhì)可知,以黑曲霉zju-Y1為菌株開(kāi)發(fā)的復(fù)合酶制劑中各酶在40℃-60℃的反應(yīng)溫度范圍和pH3.0-7.0范圍內(nèi)偏酸性環(huán)境中內(nèi)均能保證較好的酶活力以及穩(wěn)定性。經(jīng)家禽/家畜的體外模擬消化試驗(yàn)后,復(fù)合酶制劑可有效提高飼料消化率,與a-半乳糖苷酶單酶添加相比較,對(duì)寡糖的降解更具優(yōu)勢(shì)。
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